2020年05期

产物可直接进行“TA”克隆的高保真PCR法

作  者 孙达权,张钦真,胡桐,湛钊,石松,薛殿婷
第一作者 孙达权
作者单位 贵州医科大学基础医学院, 贵州贵阳
卷  号 48
发表年份 2020
发表刊期 5
发表页面 109-111,116
关  键  字 聚合酶链式反应;DNA聚合酶;“TA”克隆;DNA突变
摘  要 [目的]介绍一种PCR产物直接进行“TA”克隆的高保真PCR法,减少高保真PCR产物“TA”克隆的中间步骤。[方法]Trizol法提取人肝癌细胞SMMC-7721总RNA,并将mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,联合不同特性的Taq DNA聚合酶扩增PKC基因的蛋白编码区。PCR产物经纯化后进行“TA”克隆、细菌转化、筛选培养、质粒抽提、酶切鉴定和测序鉴定等。[结果]高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物未发现DNA突变,但不能直接进行“TA”克隆。Taq DNA聚合酶扩增的产物可直接进行“TA”克隆,但其内部存在多个突变位点,保真性明显不足。联合使用高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶(双酶联用)扩增的PCR产物可直接进行“TA”克隆,且DNA测序未发现突变。[结论]双酶联用PCR可以获得高保真PCR产物,并直接进行“TA”克隆。
附  件 产物可直接进行“TA”克隆的高保真PCR法
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